lunes, 14 de marzo de 2011

La Hibridación Fluorescente In Situ (FISH)

La Hibridación Fluorescente In Situ (FISH)

La hibridación fluorescente in situ es una técnica de laboratorio que determina cuántas copias de un segmento específico de ADN existen en una célula. También se utiliza para identificar cromosomas con estructuras anómalas. En el laboratorio, se modifica químicamente un segmento de ADN y se lo marca de manera que pueda ser visto fluorescente (muy brillante) utilizando un microscopio especial. Este ADN se conoce como "sonda". Cuando se las coloca en las células bajo ciertas condiciones, las sondas pueden detectar segmentos homólogos de ADN.

Por ejemplo, si se sospecha que un bebé padece del síndrome de Down de trisomía 21 y se realiza una amniocentesis durante la gestación, las células detectadas en el líquido amniótico pueden estudiarse a través de una hibridación fluorescente in situ. Una sonda hecha para el cromosoma 21 puede determinar la cantidad de copias del cromosoma 21 que el bebé posee. Con un microscopio especial, se vería que las células del bebé con trisomía 21 contienen tres "marcas" o tres áreas brillantes, en donde la sonda detectó los tres cromosomas 21. El estudio de hibridación fluorescente in situ no reemplaza un estudio cromosómico estándar, sino que lo complementa según el defecto congénito del que se trate.

La hibridación fluorescente in situ se puede utilizar para detectar anomalías cromosómicas estructurales (como las delecciones submicroscópicas) que se encuentran más allá de la resolución de los estudios cromosómicos de bandeo extendido.

"Telómero" es un término que se utiliza para describir los extremos de los cromosomas. Cuando se utiliza la hibridación fluorescente in situ (su sigla en inglés es FISH) específicamente para buscar anomalías cromosómicas en esta zona, se la denomina " examen subtelomérico FISH" .

Las sondas usadas en la FISH se pueden clasificar en:

Sondas que identifican una estructura específica y repetitiva del cromosoma

Estas sondas hibridan con las secuencias α y ß satélite adyacentes al centrómero, que son específicas de cada centrómero, pero que varían de un cromosoma a otro. Las sondas centroméricas permiten identificar alteraciones de tipo numérico, especialmente monosomías y trisomías y otras aneuploidías tanto en las cromosomopatías (Síndrome de Turner, síndrome de Down, síndrome de Klinefelter) como en los tumores (trisomía 8 o monosomía 7 en leucemias agudas).

Hibridación in situ fluorescente de color en un enfermo con leucemia aguda mieloblástica y pérdida en 7q. El centrómero del 7 se observa en color verde y en color rojo está marcada una secuencia específica de 7q. Se advierte la presencia de una pérdida de 7q tanto en metafase como en interfase.

Sondas que hibridan simultáneamente con múltiples secuencias del cromosoma

Se denominan sondas de pintado cromosómico a aquellos fragmentos de ADN que se obtienen mediante separación cromosómica por citometría de flujo y se marcan directamente mediante DOP-PCR. Sólo pueden utilizarse en metafase y sirven para detectar alteraciones estructurales (translocaciones, cromosomas marcadores, derivativos, etc.) difíciles de identificar con la citogenética convencional, como la t(12;21)(p12;q22) en la leucemia aguda linfoblástica B del niño.

Sondas que hibridan con una única secuencia de ADN

Estas sondas permiten sobre todo detectar reordenamientos estructurales de genes o de regiones cromosómicas concretas. Para poder utilizarlas es necesario conocer a priori la región candidata a estudio en cada patología. Sus aplicaciones son: a) la detección de translocaciones cromosómicas tales como la t(9;22)(q34;q11), con fusión de los genes BCR y ABL, en la leucemia mieloide crónica o la t(11;14)(q13;q32), donde BCL-1 se transloca a la región de la cadena pesada de las inmunoglobulinas, en el linfoma del manto (fig. 3); b) el estudio de pérdidas de genes concretos, como el gen del síndrome de Prader-Willi, o la pérdida de P53 en tumores, y c) el estudio de genes que se amplifican, es decir, se multiplican de manera considerable en el núcleo de la célula tumoral, como N-MYC en el neuroblastoma.

Fig. 3. Hibridación in situ fluorescente en interfase y metafase de un enfermo con linfoma del manto y t(11;14). La sonda específica del gen en la cadena pesada de las inmunoglobulinas se ha en verde y la del gen de la ciclina D1 (BCL-1) en rojo. Se observa la presencia de fusión de ambos genes en los dos cromosomas derivativos y en el núcleo en interfase (flechas)

Análisis de Microarreglo Cromosómico

Un análisis de microarreglo cromosómico (CMA, por sus siglas en inglés) es un nuevo análisis que se utiliza para detectar desequilibrios cromosómicos a una resolución mayor que las técnicas cromosómicas estándar actuales o las técnicas FISH.

Una muestra del ADN del individuo a examinar y una muestra de ADN para control se disponen en un orden (arreglo) particular sobre un portaobjetos de vidrio. A las muestras de ADN se añade colorante fluorescente. Luego se colocan los portaobjetos en un lector especial que mide el brillo de cada área fluorescente.

Este proceso busca identificar un cambio en el número de copias de ADN. Estos en los números de copias de ADN pueden representar cambios observados en la población general, los cuales no causan enfermedades genéticas. Sin embargo, algunos cambios en los números de copias pueden indicar una anomalía cromosómica, como un desequilibrio cromosómico, pérdida o ganancia. Los tipos de anomalías cromosómicas pueden incluir pequeñas reordenaciones cromosómicas, pequeñas duplicaciones de material cromosómico (trisomia), o pequeñas supresiones de material cromosómico (monosomia). Entre los tipos de microarreglos tenemos:

Microarreglos que detectan ganancias y pérdidas de genes (pérdida de heterogenicidad)

Ciertas pérdidas o ganancias cromosómicas están relacionadas con la progresión del cáncer y los patrones de estos cambios son importantes para establecer un pronóstico clínico. Con el uso de microarreglos y el análisis de sus resultados se podría predecir cuáles regiones cromosómicas contienen genes que inician y mantienen procesos tumorales. Los resultados pueden ser visualizados en diagramas jerárquicos referidos como " modelos en árbol de progresión del tumor" .

La técnica de Microarreglos de Hibridización Genómica Comparativa permite visualizar ganancias y pérdidas o cambios en el número de copias de un gen particular involucrado en determinada patología. En este tipo de microarreglos se usan grandes porciones de ADN genómico que sirven como ADN inmovililizado en el plato y cada o spot de ese ADN representa una región cromosómica conocida. La mezcla a hibridizar contendrá ADN genómico marcado, proveniente de tejido enfermo y tejido sano. Si el número de copias del gen de interés están aumentadas, una gran cantidad de ADN de la muestra se hibridizará en los puntos o spots del microarreglo que representan el gen involucrado, mientras que al utilizar muestra proveniente de tejido sano sólo un pequeño número se hibridizará en el mismo punto. Dicha diferencia en la cantidad de material hibridizado podrá reflejarse en fluorescencias disímiles y así será detectado por el escáner y por los programas de lectura.

Microarreglos que detectan mutaciones en el ADN

Cuando se utilizan los microarreglos para detectar mutaciones o polimorfismos en una secuencia génica, el ADN inmovilizado suele ser un único gen; el material colocado en otros pozos puede diferir solamente en o en unos cuantos nucleótidos. Un tipo de secuencia que suele utilizarse para este tipo de análisis son los Single Nucleotide Polymorphism (SNP) o Polimorfismo de nucleótido único, pequeña variación genética que puede ocurrir dentro del ADN de un individuo. En este tipo de experimento se necesita ADN genómico derivado de una muestra normal para ser usado en la mezcla de hibridización. Una vez que los investigadores han establecido que un SNP se relaciona con una enfermedad de interés, pueden usar la tecnología para detectar quiénes tienen o son susceptibles de tener la enfermedad. Cuando el ADN genómico de un individuo se hibridiza con un arreglo cargado de varios SNPs, el ADN muestra (target) se hibridizará con mayor frecuencia con los SNPs asociados al individuo a estudio. Estos puntos del microarreglo tendrán mayor fluorescencia y se demostrará que dicha persona es susceptible o tiene determinada enfermedad

Hibridación genómica comparada

En la HGC se produce la hibridación de ADN tumoral y ADN normal frente a cromosomas normales. Esta técnica presenta la ventaja de no necesitar material en fresco, ya que el ADN se puede obtener de tejido en parafina. Con ella se pueden conocer alteraciones numéricas (pérdidas o ganancias de material genómico), pero no la presencia de translocaciones recíprocas. Su aplicación al estudio de los tumores ha puesto de manifiesto que en la mayoría de las neoplasias hay alteraciones genéticas.

Fundamento de la hibridación genómica

La HGC consiste en la hibridación competitiva entre ADN tumoral (test) y ADN normal (referencia) sobre metafases normales en presencia de un exceso de ADN Cot-1 humano. Previamente, el ADN tumoral y el ADN normal han sido marcados con dos fluorocromos diferentes (por ejemplo, el ADN tumoral con un fluorocromo verde y el ADN normal con uno rojo) lo que permitirá su posterior identificación mediante un microscopio de fluorescencia. El análisis digital de las metafases capturadas cuantifica

la proporción de verde y de rojo en todos los cromosomas de manera que si existe una ganancia de material genético en una determinada región cromosómica se producirá un aumento de la fluorescencia verde a ese nivel, mientras que si hay una pérdida de material genético se producirá una disminución de la fluorescencia verde y por tanto un aumento relativo de la fluorescencia roja. El cariotipaje posterior se realiza sobre la base de la tinción con DAPI de los cromosomas.

La HGC ha sido la técnica combinada de citogenética e hibridación in situ fluorescente que ha permitido realizar un análisis global del genoma. Puesto que las alteraciones en el número de copias de ADN de determinadas regiones tienen una gran importancia en la patogenia del cáncer, la HGC ha despertado gran interés en el estudio de las neoplasias. La HGC ha sido utilizada de forma más amplia en el estudio de los tumores sólidos que de las neoplasias hematológicas, entre otras razones por la dificultad que entraña obtener mitosis en los tumores sólidos, y porque los reordenamientos no recíprocos y las amplificaciones génicas se producen con más frecuencia en ellos que en las neoplasias hematológicas. No obstante, puesto que la HGC no requiere metafases de las células tumorales y no está afectada por la selección clonal inherente a los cultivos celulares, se ha utilizado en hemopatías malignas. Las neoplasias linfoides B representan el grupo más estudiado y más concretamente los linfomas no Hodgkin (LNH) en los que se ha demostrado que las amplificaciones constituyen una alteración más frecuente de lo que se suponía, y que se asocian generalmente a linfomas agresivos. Otra aportación importante de la HGC al conocimiento

de la patogenia de los linfomas ha sido la demostración de que la amplificación es otro mecanismo que causa sobreexpresión de la proteína bcl-2, añadido al ya conocido mecanismo de translocación.


FUENTE: monografias.com

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